核酸固相合成原理（一）發表時間：2024-08-06 18:08 SYNTHESIS 核酸固相合成原理（一） Nucleic acid synthesis I 核酸的合成主要有生物法合成和化學法合成兩大類方法。生物法合成是以三磷酸核苷（NTP）作為原料，以互補鏈作為模板，在核酸聚合酶的作用下進行聚合來制備核酸。化學法合成是以核苷的亞磷酰胺單體作為原料，在載體上固相合成來實現的。固相合成的基本原理（如圖1）所示。  圖1. 核酸的固相合成原理 核苷亞磷酰胺的典型化學結構（如圖2）所示，其以核苷作為基本單元，在其5’端羥基引入4, 4’-二甲氧基三苯甲基（DMT）作為羥基的保護單元，3’端引入N,N’-二異丙胺基-O-氰乙基亞磷酰胺作為活性單元，在堿基的胺基（在脫氧腺苷dA中為6-NH2）上引入酰胺鍵，來避免胺基參與過多的副反應。  圖2. 脫氧核苷亞磷酰胺的化學結構(以脫氧腺苷dA為例) 化學法合成一般需要再固相載體上進行，固相載體主要有多孔玻璃微球（controlled pore glass, CPG）和聚苯乙烯（polystyrene, PS）微球兩大類。CPG 是一類具有大量孔道的硅基材料（如圖3所示），需要在其表面上進行化學修飾才可以用于核酸的固相合成。CPG 具有良好的化學穩定性和機械強度，適用于各種規模的核酸合成。其孔徑和載量以及合成序列的長度具有直接關系，CPG 孔徑越小，負載量越高，但是僅能用于短鏈核酸的合成；CPG 孔徑越大，負載量越低，但是可以合成長鏈的核酸（表1）。PS 微球載量要遠高于 CPG，載量可達 200-400 μmol/g，在合成短鏈核酸方面有著巨大的優勢。  圖3. 多孔玻璃微球在電鏡下的孔道結構  表1. 不同孔徑 CPG 的載量和適用范圍 第一代 CPG 上多將核苷預修飾在孔道表面，預修飾的核苷即為目標序列的3’端的第一個核苷（如圖4）。該類修飾目前已較少使用。目前市面上的主要產品是通用型的修飾（如圖5），CPG 上修飾的是含有橋環或者糖環結構的一些有機單元，在上面可以進行任意核苷序列的合成，具有非常好的通用性。  圖4. 第一代核酸固相載體  圖5. 第二代核酸固相載體 核酸固相合成的四個階段 SYNTHESIS 脫保護 Deblock/Deprotection 核酸的固相合成主要分四個合成階段，第一階段為脫保護（deblock），有時也被稱作 deprotection，該步驟使用有機酸對載體上的 DMT 單元進行脫保護，將羥基上的 DMT 單元切除，裸露出羥基。該步驟中使用的酸主要是 3% 的三氯乙酸在二氯甲烷中的溶液，也可以使用二氯乙酸在二氯甲烷中的溶液，大規模合成時，也可以使用二氯乙酸在甲苯中的溶液。 縮合 Coupling 第二階段為縮合（coupling），該步驟將核苷亞磷酰胺單體在縮合試劑（activator）作用下和上一步裸露出來的羥基縮合，形成亞磷酸三酯。該步驟中使用的縮合試劑有四唑，5-乙硫基四唑（ETT），5-芐硫基四唑（BTT），4,5-二氰基咪唑（DCI）以及吡啶三氟乙酸鹽等。 封端 Capping 第三階段為封端（capping），該步驟將上一步沒有和核苷亞磷酰胺單體完成縮合的羥基進行酰基化封端，避免該羥基參與后續的反應，引入雜質。該步驟使用兩種試劑，cap A 和 cap B，其中 cap A 的主要成分為乙酸酐或異丁酸酐，溶劑為乙腈或四氫呋喃；cap B 的主要成分為1-甲基咪唑、吡啶或2,6-二甲基吡啶等有機堿，溶劑為乙腈或四氫呋喃。 氧化/硫代 Oxidation/Sulfurization 第四個階段為（oxidation/sulfurization）。在氧化步驟中，主要使用碘將化學不穩定的亞磷酸三酯氧化為化學穩定的磷酸三酯。在硫代步驟中，使用硫代試劑將亞磷酸三酯轉化為硫代磷酸三酯。 上述四個步驟為合成一個核苷的基本循環，當氧化結束后，在固相載體上就完成了一個核苷酸的增長；重復這個循環，就可以得到固載在載體上的目標核酸序列。 |
